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Elmer lublin wojciechowska agnieszka

Die zunehmende Zahl von Hinweisen deutet darauf hin, dass die Toxizität von Nanomaterialien mit der Erzeugung von oxidativem Stress verbunden ist. In diesem Artikel untersuchten wir die Rolle der Atmung in Silbernanopartikeln. AgNPs erzeugten oxidativen Stress und Toxizität.

Da Krebszellen auf Glukose als Hauptenergiequelle angewiesen sind, könnte die Verfügbarkeit von Glukose eine wichtige Determinante für die Toxizität von NPs sein. AgNPs mit einem Nenndurchmesser von 20 nm wurden als Modell-NPs verwendet. HepG2-Zellen wurden in Medien mit hohen 25 mM oder niedrigen 5 kultiviert. Die durch AgNPs induzierte Toxizität wurde durch einen Neutralrot-Assay getestet. Die Erzeugung von H2O2 in Mitochondrien wurde unter Verwendung des Mitochondrien-spezifischen Proteinindikators HyPer-Mito bewertet.

Die Expression von 77 Genen, die mit oxidativem Stress zusammenhängen, wurde durch qPCR bewertet. Die Aktivität von antioxidativen Enzymen wurde kolorimetrisch durch spezielle Methoden in Zellhomogenaten geschätzt.

AgNPs-induzierte dosisabhängige Erzeugung von H2O2 und Toxizität wurden beobachtet. Die Toxizität von AgNPs gegenüber Zellen, die im Medium mit niedriger Glukose gehalten wurden, war signifikant geringer als die Toxizität gegenüber Zellen, die in der hohen Glukosekonzentration wachsen. Die Knappheit der Glukoseversorgung führte zu einer Hochregulierung der endogenen antioxidativen Abwehrmechanismen, die wiederum die AgNP-abhängige ROS-Erzeugung und -Toxizität verringerten. Die Verfügbarkeit von Glukose kann die Toxizität von AgNPs durch Erhöhung der durch oxidativen Stress ausgelösten antioxidativen Abwehr verändern, die durch eine verstärkte oxidative Phosphorylierung in Mitochondrien und die damit verbundene Erzeugung von ROS verursacht wird.

Die präsentierten Ergebnisse stärken die Idee einer starken Verknüpfung zwischen der Toxizität von NPs und der intrazellulären Atmung und möglicherweise anderen mitochondrienabhängigen Prozessen. In der Umwelt vorhandene Nanopartikel-NPs, sowohl natürlichen Ursprungs als auch anthropogen, können erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben. Das Vorhandensein der NPs im Körper führt zu pathophysiologischen Veränderungen, die zur Entstehung von Krebs [1], Herz-Kreislauf-Erkrankungen [2], Entzündungen der Atemwege [3], neurodegenerativen Erkrankungen [4, 5] und vielen anderen Pathologien [6] beitragen können. .

Silber-NPs AgNPs gehören trotz ihrer Berichterstattung zu den am weitesten verbreiteten Produkten im täglichen Leben. Die akkumulierten Beweise deuten darauf hin, dass die schädliche Wirkung von AgNPs mit der Induktion von oxidativem Stress verbunden ist [7, 8]. Oxidativer Stress wird am häufigsten als Ungleichgewicht in der zellulären Produktion und im Verbrauch der reaktiven Sauerstoffspezies ROS beschrieben. Obwohl ROS bei vielen physiologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen, ist das Redox-Ungleichgewicht mit vielen Pathologien verbunden, wie Parkinson [9], Morbus Crohn, durch T-Zellen vermittelte Hauterkrankungen, Diabetes, Krebs, Leigh-Syndrom und anderen mitochondrialen Erkrankungen.

Dieser Artikel wird unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution 4 verbreitet. Ein vorgeschlagener Mechanismus für dieses Phänomen beinhaltet eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration, die durch die Funktion des Dynamin-ähnlichen Proteins 1 zu einer mitochondrialen Spaltung führt [12], die zur Apoptose führt [13 ].

Es wurde berichtet, dass eine nur 2-mal höhere Glukosekonzentration von 50 mM als die in Standard-DMEM mit hohem Glukosegehalt verwendete zur Apoptose von HepG2-Zellen führt [14]. Ergebnisse von In-vitro-Studien zum Zusammenhang zwischen erhöhter Glukosekonzentration und Hemmung der Zellproliferation in den Modellzelllinien korrelieren mit In-vivo-Ergebnissen. Bei Patienten mit Typ-2-Diabetes wird ein massiver Verlust von Beta-Zellen beobachtet, der mit oxidativem Stress verbunden ist, der durch die Hemmung der Glucose-6-Phosphatase induziert wird [15].

Unter physiologischen Bedingungen sind die meisten normalen Zellen auf OXPHOS angewiesen, während der Metabolismus von Krebszellen hauptsächlich auf dem sogenannten Warburg-Effekt der Glykolyse beruht [16]. Der Warburg-Effekt kann eine Anpassung an die begrenzte Sauerstoffversorgung sein, da eine frühe Entwicklung von Krebszellen normalerweise in einer hypoxischen Umgebung des wachsenden Tumors stattfindet, der eine begrenzte Blutversorgung aufweist, bis sich eine eigene Gefäßkultur entwickelt, oder auf das Schließen zurückzuführen ist Down of Mitochondrien, um die Apoptose zu verhindern [17].

Da viele Berichte die Induktion von oxidativem Stress durch NPs beschreiben und es eine Reihe von Prämissen gibt, die die Toxizität von NPs mit oxidativem Stress verbinden [18, 19], wobei der Schwerpunkt auf der ROS-Erzeugung in den Mitochondrien liegt, ist es von großem Interesse festzustellen, ob Die Verfügbarkeit von Glucose kann die Toxizität von NPs verändern. Ziel dieser Studie war es daher zu bestimmen, wie sich die Verfügbarkeit von Glukose und die damit verbundenen Änderungen des Redoxgleichgewichts auf die Toxizität von NPs auswirken.

Der hydrodynamische Durchmesser der Nanopartikel und das Zetapotential wurden mittels DLS gemessen. Der hydrodynamische Durchmesser von AgNPs mit einer Nenngröße von 20 nm war ungefähr 8-mal höher, wenn er in albuminhaltigem Puffer gemessen wurde.

Die Zunahme des hydrodynamischen Durchmessers von NP in proteinhaltigem Medium ist ein bekanntes Phänomen, das normalerweise auf die Bildung von Proteinkorona zurückgeführt wird [20]. Hoher negativer Zetapotentialwert -47. Dies wurde durch Längsschnittanalyse weiter bestätigt. Weder der hydrodynamische Durchmesser, das Zetapotential noch der Polydispersitätsindex änderten sich über die 2 Stunden deutlich, was auf keine Agglomeration hinweist. Tabelle 1. Ähnliches AgNP-Verhalten und. Ein Vergleich der Überlebenskurven zeigt eine statistisch signifikante Schutzwirkung der Langzeitkultur in Medium mit niedrigem Glucosegehalt gegen durch AgNPs induzierte Toxizität.

Die Übertragung von Zellen auf ein Medium mit niedrigem Glucosegehalt für 24 Stunden vor der AgNP-Behandlung führte zu einem ähnlichen, aber dennoch geringeren, nicht signifikanten Effekt. Die anschließende Analyse der Zellüberlebenskurven zeigte einen abnehmenden Unterschied in den wirksamen Konzentrationen von AgNPs, die zur Induktion der Toxizität auf dem bestimmten Niveau erforderlich sind, zwischen Zellen, die auf DMEM mit hohem und niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden, und Zellen, die für lange und kurze Zeit in Medium mit niedrigem Glucosegehalt kultiviert wurden Tabelle 2.

In Vorversuchen haben wir überprüft, ob der unterschiedliche Glucosegehalt im Kulturmedium die Wachstumsrate von HepG2-Zellen beeinflusst. Es wurden keine statistisch wichtigen Unterschiede gefunden. Student's "t" -Test, Daten nicht gezeigt. Um die Reaktivität und Empfindlichkeit des HyPer-Mito-Proteins in unserem System in Bezug auf H2O2 zu quantifizieren, haben wir die HyPer-Mito-transfizierten Zellen mit exogenem H2O2 behandelt und die Fluoreszenz des HyPer-Mito-Proteins gemessen.

Wir fanden eine hyperbolische Abhängigkeit der Fluoreszenz von der H2O2-Konzentration mit einem Sättigungseffekt über 100 M H2O2. Abb. Daher wurde die Konzentration von 25 M als positive Kontrolle für die weiteren Experimente gewählt, da diese die Aufwärts- und Abwärtsbewegung ermöglicht Modifikation der Fluoreszenzwerte.

3 zeigt die Erzeugung von H2O2 in Mitochondrien von HepG2-Zellen, die in verschiedenen Glucosekonzentrationen kultiviert und mit AgNPs behandelt wurden. Abbildung 3b. Grafische Punkte repräsentieren Mittelwerte mit SD. Tabelle 1 Hydrodynamischer Durchmesser, Zetapotential und Aggregation von Silbernanopartikeln über 2 h, die in dieser Arbeit mit einer Nenngröße von 20 nm verwendet wurden. Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der H2O2-Erzeugung durch Mitochondrien zwischen Kontrollzellen und mit AgNPs behandelten Zellen beobachtet.

In Kontrollzellen ohne AgNPs, die auf Medien mit niedrigerer Glucosekonzentration gehalten werden, kann eine höhere Fluoreszenzintensität beobachtet werden als in solchen, die auf Medien mit hohem Glucosegehalt gehalten werden. Um den Mechanismus, der der unterschiedlichen Empfindlichkeit von HepG2, das auf Medium mit niedrigem und hohem Glucosegehalt kultiviert wurde, gegenüber AgNPs zugrunde liegt, weiter zu untersuchen, wurde die Expression von Genen, die mit der zellulären Reaktion auf oxidativen Stress zusammenhängen, in Tabelle 3 bewertet.

Es wurde ein deutlicher Anstieg der Expression mehrerer Gene beobachtet, die Proteine ​​codieren, die direkt an der oxidativen Abwehr beteiligt sind. Unter diesen wurde die bemerkenswerteste Änderung für die ALB 8 beobachtet. H202-Konzentration [j. M] Abb. Interessanterweise wurden mehrere Gene herunterreguliert. Zu den am signifikantesten herunterregulierten Genen gehören: Bemerkenswerterweise codieren mehrere herunterregulierte Gene Proteine, die an der Glutathionsynthese und dem Metabolismus beteiligt sind.

Die Expression von 33 Genen unter 72 untersuchten wurde durch die Langzeitkultur auf dem Medium mit niedrigem Glucosegehalt nicht beeinflusst. Zusätzlich zur Transkriptomanalyse wurde die enzymatische Aktivität der Proteine, die eine entscheidende Rolle bei der zellulären Antioxidansabwehr spielen, bewertet. Tabelle 4

Die Katalaseaktivität war erhöht. 1. Die Glutations-S-Transferase- und Glutationsreduktaseaktivitäten waren erhöht. 1. HepG2-Zellen sind ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Auswirkungen von Glukose auf den Zellstoffwechsel und die Reaktion auf verschiedene Stimuli, da diese Zellen in beiden leicht gezüchtet werden können , Medien mit niedrigem und hohem Glucosegehalt [22]. Als aus der Leber stammende Zelllinie, eines der Zielorgane für die durch Nanopartikel vermittelte Toxizität, sind HepG2-Zellen auch ein anerkanntes Modell für Nanotoxizitätstests, einschließlich der AgNP-Toxizität.

Die Toxizität von AgNPs wurde in verschiedenen Systemen nachgewiesen, die von den Modellzelllinien in vitro bis zu kleinen Tieren reichen. In der vorliegenden Studie wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch den Neutralrot-Assay bewertet. Dieser Assay ist weniger anfällig für Artefakte als der üblicherweise verwendete MTT-Assay, da die Reduktion von Tetrazoliumfarbstoffen stark vom Stoffwechselzustand der Zelle abhängt, insbesondere von der Aktivität von NAD P H -abhängigen Oxidoreduktasen [15].

Der Neutralrot-Lebensfähigkeitstest basiert auf der Farbstoffakkumulation in Lysosomen lebensfähiger Zellen und scheint weniger von Schwankungen im Redoxzustand der Zellen abhängig zu sein.

Trotz des verwendeten Tests bestätigen veröffentlichte Ergebnisse wiederholt die Toxizität von AgNPs [8]. Bei der Analyse der Überlebenskurven für HepG2-Zellen, die in Medien mit unterschiedlicher Glucosekonzentration kultiviert und mit AgNPs behandelt wurden, beobachteten wir einen Anstieg der Resistenz. Extrazelluläres H2O2 25 jM wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Ergebnisse wurden gegenüber unbehandelten Kontrollzellen normalisiert und die statistische Bedeutung der Unterschiede wurde mit ANOVA berechnet, begleitet von Tukeys Post-Hoc-Test.

Werte repräsentieren Mittelwerte mit SD. Die Werte stellen Mittelwerte mit Standardabweichung dar. Dieser Effekt ist besonders bei hohen Überlebensraten sichtbar, z.

Es gab keinen Unterschied zwischen Zellen, die 24 Stunden lang auf Medium mit niedrigem Glucosegehalt wuchsen, und solchen, die auf Medium mit hohem Glucosegehalt wuchsen. Diese Ergebnisse weisen eindeutig auf die Existenz der Anpassungsmechanismen in Zellen mit niedrigem Glukosewachstum hin, die die.

Obwohl die Mechanismen der AgNP-Toxizität noch diskutiert werden, ist sie höchstwahrscheinlich mit der Induktion von oxidativem Stress verbunden. Die Induktion des oxidativen Stresses durch AgNPs wurde in verschiedenen Systemen in vitro und in vivo nachgewiesen [7, 8, 22]. NADPH-Reduktase [24].

Während fluoreszierende Sonden, die üblicherweise zur Beurteilung der ROS-Erzeugung verwendet werden, entweder nicht spezifisch oder schwer auf das jeweilige Zellkompartiment abzuzielen sind, haben wir in dieser Arbeit die Erzeugung von H2O2 in Mitochondrien von mit AgNPs behandelten HepG2-Zellen direkt und spezifisch durch die Verwendung von gezielten Mitochondrien bestätigt. H2O2-spezifisches HyPer-Mito-Reporterprotein.

Im Gegensatz dazu erhöhte die Behandlung mit AgNPs die Erzeugung von H2O2 in HepG2-Zellen, die auf Medium mit niedrigem Glucosegehalt gezüchtet wurden, in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Überlebensdaten nicht. Eine plausible Erklärung für dieses Phänomen ist eine Intensivierung der antioxidativen Abwehrsysteme, die die durch AgNPs induzierte ROS-Toxizität verringern.

In der Tat ergab die Analyse der enzymatischen Aktivität der Schlüsselenzyme des zellulären antioxidativen Abwehrsystems einen statistisch signifikanten Anstieg der Aktivitäten aller getesteten Enzyme, einschließlich Katalase, Glutathion-S-Transferase, Glutathionreduktase und Superoxiddismutase Oxidativer Stress führt normalerweise zu einer Zellmembranverletzung und einer Schädigung von Makromolekülen und Organellen, die zum Zelltod führen. Die Aktivierung der antioxidativen Anpassungsreaktion bei einem moderaten Grad an oxidativem Stress ist ein bekanntes Phänomen.

Darüber hinaus wurde bereits die Anpassung von HepG2-Zellen an durch AgNPs induzierten oxidativen Stress als Mechanismus vorgeschlagen, der die Unterschiede in der Reaktion auf Nanosilber zwischen HepG2- und A549-Zelllinien erklärt [30]. In dieser Arbeit wurde eine unterschiedliche AgNP-Empfindlichkeit von HepG2- und A549-Zellen mit der Hochregulation pro-proliferativer und anti-apoptotischer Signalwege in Verbindung gebracht.

In unserem Versuchsaufbau führte eine beobachtete Zunahme der Aktivitäten von antioxidativen Enzymen zu einer Anpassung an einen Zustand mit niedrigem Glucosegehalt und einer damit einhergehenden Zunahme von oxidativem Stress. Der Einfluss von Glukose auf den Zellstoffwechsel wurde umfassend untersucht, und es gibt zahlreiche Daten zu den Auswirkungen der Verfügbarkeit von Glukose auf die Induktion von oxidativem Stress.

Eine hohe Glukosekonzentration führt zu einer erhöhten Proteinglykation, bietet jedoch eine nachhaltigere Umgebung für das Zellwachstum. Eine erhöhte mitochondriale Proteinglykation und Akkumulation fortgeschrittener Glykationsendprodukte kann jedoch zu einer mitochondrialen Dysfunktion und oxidativem Stress führen, wie an C gezeigt wurde. Andererseits wurde die ROS-Erzeugung auch mit einer geringen Glukoseverfügbarkeit in Verbindung gebracht [33]. Dies steht im Einklang mit Berichten über die Umstellung des Zellstoffwechsels von Glykolyse auf OXPHOS [10, 34].

Unter physiologischen Bedingungen ist die Glykolyse der vorherrschende Weg zur Energieversorgung in Krebszellen. Daher zwingt die Glukoseknappheit den Stoffwechsel zurück zu OXPHOS, dem sogenannten Warburg-Effekt [35].

Das Phänomen des metabolischen Wechsels zwischen Glykolyse und Atmungskette als Reaktion auf die Verfügbarkeit von Glucose wurde in einer Vielzahl von Versuchsanordnungen beobachtet, die von Hefe bis zu Säugetierzelllinien reichten [36, 37]. Diese Erklärung war jedoch. Darüber hinaus betrachten viele Autoren den Warburg-Effekt als Ergebnis der Unterdrückung von mitochondrialem OXPHOS aufgrund einer verstärkten Glykolyse und nicht aufgrund von Defekten in seiner Funktionalität.

In der Tat führte auch in unserem Versuchsaufbau eine Erschöpfung der Glukoseversorgung zu einem Stoffwechselwechsel und einer erhöhten Produktion von H2O2 in Mitochondrien aufgrund des OXPHOS. Mit zunehmendem oxidativen Stress nahmen die Zellen die neue Situation an, indem sie die Aktivität der wichtigsten antioxidativen Abwehrenzyme erhöhten. Tabelle 4

Dies wurde durch die Transkriptomanalyse weiter bestätigt.

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